Teil 2: Trennverfahren · Kapitel 11 · Proteinanalytik und elektrophoretische Trennungen

Proteinanalytik und elektrophoretische Trennungen

Proteintrennstrategien

Proteine werden nach Eigenschaften getrennt. Eine gute Methodenwahl nennt immer Eigenschaft, Verfahren und Detektion.

RP-Chromatographie ist in Peptid-/Proteinanalyse sehr wichtig, aber für Proteinaufreinigung seltener ideal, weil organische Lösungsmittel und saure Bedingungen Proteine denaturieren können. HIC, IEX und SEC sind in der präparativen Proteinreinigung oft milder.

Ionenaustausch Für Proteine

Proteine sind amphoter. Ihre Nettoladung hängt vom pH-Wert ab:

• pH unter pI: Protein ist netto positiv;
• pH über pI: Protein ist netto negativ;
• pH gleich pI: Nettoladung null.

Anionenaustauscher binden negative Proteine, Kationenaustauscher positive. Elution erfolgt meist durch Salzgradient oder pH-Änderung. Höhere Ionenstärke verringert elektrostatische Bindung durch Konkurrenz.

HIC

Hydrophobe Interaktionschromatographie nutzt schwächer hydrophobe stationäre Phasen als RP. Hohe Salzkonzentration entzieht Proteinoberflächen Hydrathüllen und fördert hydrophobe Wechselwirkung. Beim Absenken der Salzkonzentration eluieren die Proteine.

Warum IEX + HIC als Kombination stark ist: Die Bedingungen ergänzen sich gut. Nach IEX-Elution mit hohem Salz kann direkt HIC anschließen; außerdem sind Ladung und Hydrophobizität orthogonale Trennprinzipien.

SEC/Gelfiltration

SEC trennt nach Molekülgröße. Die stationäre Phase ist poröses Material mit definierter Porengröße. Große Moleküle dringen kaum in Poren ein und eluieren am Ausschlussvolumen (V_0). Kleine Moleküle dringen tiefer ein und eluieren später.

Wichtige Begriffe:

• (V_E): Elutionsvolumen eines Analyten;
• (V_0): Ausschlussvolumen/mobile Phase außerhalb der Poren;
• Fraktionierbereich: Größenbereich, in dem Moleküle nach Molmasse getrennt werden;
• Kalibration: (V_E) gegen (\log M) für Standards.

SEC hat geringe Kapazität und Trennleistung, ist aber mild. In der Biotechnologie wichtig für Aggregatentfernung, Antikörper-Dimer/Multimer-Analyse und Trennung freier/gebundener Biomoleküle.

Affinitätschromatographie

Affinitätschromatographie nutzt spezifische Bindung:

• Antikörper-Antigen;
• Rezeptor-Ligand;
• Metallchelat-Komplexe.

Bei IMAC binden His-tag-Proteine an immobilisierte Metallionen wie Ni²⁺, Co²⁺, Cu²⁺ oder Zn²⁺. Elution: Imidazol verdrängt Histidin, pH-Absenkung protoniert Histidin oder EDTA komplexiert das Metall.

SDS-PAGE

SDS-PAGE ist eine denaturierende Gelelektrophorese. SDS denaturiert Proteine und bindet so, dass Proteine ungefähr gleiches Masse-zu-Ladungs-Verhältnis erhalten. Die Eigenladung wird maskiert. Im Polyacrylamidgel trennt dann vor allem die Molekülmasse: kleine Proteine wandern schneller/weiter.

Stärken:

• einfach und robust;
• gute Auflösung;
• Protein-Ladder als Größenstandard;
• Coomassie-Färbung, Nachweisgrenze grob 50-100 ng/Bande.

Grenzen:

• denaturierend;
• nicht direkt native Aktivität;
• Quantifizierung nur eingeschränkt.

IEF

Isoelektrische Fokussierung trennt nach pI. Proteine wandern im elektrischen Feld bis zum pH-Wert ihres isoelektrischen Punkts. Dort ist ihre Nettoladung null, sie bleiben stehen. Wird ein Protein durch Diffusion verschoben, bekommt es wieder Ladung und wandert zurück: Fokussierungseffekt.

Auflösung laut Folien/Fragenkatalog: etwa 0,02 bis 0,05 pI-Einheiten.

Für Aminosäuren ohne saure/basische Seitenkette:

Kapillarelektrophorese

CE trennt in einer dünnen Fused-Silica-Kapillare bei hohen Spannungen (typisch 10-30 kV). Trennung beruht auf elektrophoretischer Mobilität.

Mobilität steigt mit:

• höherer Ladung;
• kleinerem Teilchen;
• geringerer Reibung.

Der elektroosmotische Fluss (EOF) entsteht an deprotonierten Silanolgruppen der Kapillarwand. Bei pH oberhalb von 2,5 ist die Wand negativ, Kationen lagern sich an und wandern zur Kathode; sie ziehen Flüssigkeit mit. Dadurch werden auch neutrale und viele anionische Analyten zur Kathode transportiert.

CE hat hohe Effizienz, weil das Flussprofil eher plugförmig ist, kein Massentransfer zur stationären Phase stattfindet und A-/C-Terme entfallen. Grenze: Joulesche Wärme bei hohem Strom; dünne Kapillaren lassen sich gut kühlen.