Teil 1: Spektroskopie · Kapitel 3 · UV/Vis und Fluoreszenz

UV/Vis und Fluoreszenz

UV/Vis Grundprinzip

UV/Vis-Spektroskopie misst elektronische Übergänge. Ein Molekül absorbiert ein Photon, wenn dessen Energie zu einem erlaubten Übergang passt. In Molekülen sind elektronische Übergänge mit Schwingungszuständen gekoppelt; deshalb sind UV/Vis-Banden meist breit und nicht als messerscharfe Linien sichtbar.

Wichtige Bereiche aus der Vorlesung:

Eine saubere Antwort nennt nicht nur “UV/Vis”, sondern den Chromophor: Aromaten, konjugierte Doppelbindungen, Carbonylsysteme, Farbstoffe, Häm-/Metallkomplexe oder andere π-Systeme.

Lambert-Beer

Für eine einfache, homogene, nicht streuende Probe gilt:

mit Absorbanz (A), Transmissionsfaktor (T=I/I_0), molarem Extinktionskoeffizienten (\varepsilon), Konzentration (c) und Schichtdicke (d). (A) ist einheitenlos; häufig liest du AU als Absorbance Unit.

Klausurfälle:

• Konzentration berechnen: (c=A/(\varepsilon d)).
• Verdünnung berücksichtigen: Endergebnis mit Verdünnungsfaktor multiplizieren.
• Andere Küvette: doppelte Schichtdicke gibt bei gleichem (c) doppelte Absorbanz, solange der Bereich linear bleibt.
• Zu hohe Absorbanz: verdünnen oder weniger empfindliche Wellenlänge wählen.
• Blindwert/Matrix: Lösungsmittel, Puffer oder Gradient können selbst absorbieren; Blank/Baseline abziehen.

Typische Interpretation: (A=1) bedeutet 10 % Transmission, (A=2) bedeutet 1 % Transmission. Bei sehr kleiner Restintensität wird die Messung empfindlich gegen Streulicht, Detektorrauschen und nichtlineare Effekte.

Chromophore In Bioanalytik

Für Proteine und Bioproben tauchen besonders diese Wellenlängen auf:

• ca. 200 nm: Peptidbindung; sehr empfindlich, aber viele Moleküle absorbieren dort ebenfalls. Je kürzer die Wellenlänge, desto unspezifischer.
• ca. 260 nm: Nukleinsäuren; wichtig bei DNA/RNA.
• ca. 280 nm: aromatische Aminosäuren, vor allem Tryptophan und Tyrosin, schwächer Phenylalanin. Gut für Proteinabschätzung, aber vom Aminosäureprofil abhängig.
• sichtbarer Bereich: Farbstoffe, prosthetische Gruppen, Hämgruppen, Metallkomplexe.

Normales Laborglas ist im UV nur begrenzt geeignet, weil es im UV-Bereich absorbiert. Für tieferes UV nutzt man Quarzglas oder geeignete UV-Kunststoffe.

Geräteaufbau UV/Vis

Das Standardraster:

1. Strahlungsquelle: Deuteriumlampe für UV, Wolfram/Halogen für Vis.
2. Wellenlängenselektion: Filter, Prisma oder Beugungsgitter im Monochromator.
3. Probe: Küvette, meist 1 cm Schichtdicke; Material muss transparent sein.
4. Detektor: Photodiode, Diodenarray oder Photomultiplier.
5. Auswertung: Intensität vor/nach Probe, Absorbanz, Kalibriergerade.

Einstrahlwinkel, Reflexion, Streuung, verschmutzte Küvetten, Luftblasen und falscher Blank sind typische praktische Fehlerquellen.

Fluoreszenz Grundprinzip

Fluoreszenz ist Emission nach elektronischer Anregung. Nach Absorption verliert das Molekül einen Teil der Energie strahlungslos, dann wird ein Photon emittiert. Die Emission ist daher meist energieärmer und längerwellig als die Anregung.

Zeitfenster aus der Vorlesung:

• Absorption: ungefähr (10^-15) s.
• Vibrationsrelaxation/internal conversion: etwa (10^-14) bis (10^-10) s.
• Fluoreszenz: etwa (10^-9) bis (10^-7) s.
• Phosphoreszenz: deutlich langsamer, oft (10^-3) s bis Sekunden.

Abgrenzung:

• Fluoreszenz: schnelle Emission aus Singulett-Zustand.
• Phosphoreszenz: langsamere Emission über Triplett-Zustand.
• Lumineszenz: Oberbegriff für Lichtemission ohne reine Wärmestrahlung.

Warum Fluoreszenz In Der Bioanalytik Stark Ist

Fluoreszenz misst nicht das “fehlende” Licht wie UV/Vis, sondern neu emittiertes Licht. Der Detektor steht häufig 90° zur Anregung. Dadurch trifft weniger Anregungslicht direkt auf den Detektor, der Untergrund sinkt und die Empfindlichkeit steigt.

Vorteile:

• hohe Empfindlichkeit, oft deutlich besser als UV/Vis;
• hohe Selektivität durch Kombination aus Anregungs- und Emissionswellenlänge;
• geeignet für Spurenanalytik, HPLC-FLD, Mikroskopie, FACS, qPCR, Sequenzierung;
• natürliche Fluorophore und Labels möglich.

Grenzen:

• nicht jedes Molekül fluoresziert;
• Matrix, Sauerstoff, pH, Lösungsmittel und Temperatur können löschen;
• Photobleaching bei intensiver Bestrahlung;
• Fluoreszenzintensität ist oft stärker methodenabhängig als einfache Absorbanzmessung.

Fluorophore Und Anwendungen

Natürliche Fluorophore: Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin, NADH/FAD und GFP. Extrinsische Fluorophore: Fluorescein, Rhodamine, Cyaninfarbstoffe, DAPI, Dansyl-/FITC-Labels und viele Protein-/DNA-Sonden.

Wichtige Konzepte:

• Quantenausbeute: Anteil der absorbierten Photonen, die als Fluoreszenz wieder emittiert werden.
• FRET: Energieübertragung zwischen nah benachbarten Chromophoren, typischer Bereich wenige Nanometer; nützlich als Abstandssonde.
• Quenching: Fluoreszenzabnahme durch Quencher oder Umgebung; in qPCR wird die Trennung von Farbstoff und Quencher analytisch genutzt.

Eine gute Klausurantwort zum Fluoreszenzphotometer nennt: Anregungsquelle, Anregungsmonochromator/Filter, Probe, Emissionsmonochromator/Filter, rechtwinklige Detektion und empfindlichen Detektor.